電鏡制樣中使用的固定劑都有毒性，操作時(shí)都要很小心，盡可能在通風(fēng)櫥中完成操作。如果實(shí)驗(yàn)室中發(fā)生固定劑泄漏，必須立即用大量奶粉覆蓋泄漏出來(lái)的溶液，待反應(yīng)充分后收集處理。
一、四氧化鋨（Osmium tetroxideOsmium tetroxide）?
????? 四氧化鋨是一種很強(qiáng)的氧化劑氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶，分子量254，飽和水溶液的，飽和水溶液的濃度為7.24%，它的水溶液為中性，有極大毒性。市售有密封的四氧化鋨晶體和四氧化鋨水溶液兩種。溶于水的速度很慢，必要時(shí)可以使用超聲波設(shè)備來(lái)加速溶解。市面上也有已經(jīng)配制好的2%四氧化鋨水溶液出售，使用相當(dāng)方便。但要特別注意的是無(wú)論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會(huì)揮發(fā)出四氧化鋨氣體，因此應(yīng)將四氧化鋨置于密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激，對(duì)眼睛有嚴(yán)重的破壞作用，因此在使用時(shí)應(yīng)特別小心，盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且嚴(yán)格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應(yīng)加入酒精水溶液或硫酸亞鐵溶液，使四氧化鋨轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低溶液毒性，方便收集處理。? 四氧化鋨作為固定劑有如下優(yōu)點(diǎn)：
????? 1.四氧化鋨可以與脂類、糖類糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對(duì)脂類的固定作用可以補(bǔ)充醛類固定劑固定不足的缺點(diǎn)。?
???? 2.能增加膜的反差，起到" 電子染色電子染色"作用。用四氧化鋨固定的材料，往往細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。 這是由于被還原的鋨沉積在細(xì)胞膜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，而鋨是一種原子序數(shù)較高的元素，能加強(qiáng)它們的電子散射（質(zhì)量密度大），所以四氧化鋨四氧化鋨作為固定劑的同時(shí)，又可作為電子染料，使被固定的樣品圖像有較好的反差。?
???? 3.四氧化鋨會(huì)破壞大部分細(xì)胞膜的半透膜特性，配制四氧化鋨固定液不用考慮特性，配制四氧化鋨固定液不用考慮滲透壓。?
????? 四氧化鋨雖然具有以上優(yōu)點(diǎn)，但它也存在不少缺點(diǎn)：
????? 固定劑四氧化鋨滲透力弱，所以組織塊要小。否則，將從組織塊表面到中間形成一個(gè)固定梯度，致使內(nèi)部自溶過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行引起組織塊內(nèi)部固定不好。不能保存糖原也不能有效固定核酸，而且對(duì)微管固定效果也不理想。
????? 固定的時(shí)間不宜太長(zhǎng)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使組織變脆，給切片帶來(lái)困難。此外四氧化鋨與蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸交聯(lián)形成的復(fù)合體都是易溶于水的物質(zhì)，特別是在長(zhǎng)時(shí)間的固定后，更易溶解。因此，使用四氧化鋨固定樣品，時(shí)間控制在12 小時(shí)較為適宜。?
????? 四氧化鋨能與乙醇或醛類起氧化－還原反應(yīng)，生成沉淀。所以，醛類處理過(guò)的樣品轉(zhuǎn)入四氧化鋨固定之前或四氧化鋨固定之后轉(zhuǎn)入乙醇溶液脫水之前都必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗干凈。?
????? 四氧化鋨是酶的鈍化劑，不能用于細(xì)胞化學(xué)的研究。?
二、多聚甲醛（formaldehyde ）?
????? 甲醛分子中只有一個(gè)碳原子碳原子，含有一個(gè)醛基，分子式為$CH_2O$，分子量分子量為30。市面上雖然有多種形式的甲醛溶液出售，但它們含有少量的甲酸和甲醇，對(duì)被固定的樣品產(chǎn)生不良影響，推薦電鏡制樣級(jí)別的多聚甲醛(paraformaldehyde，Electron Microscopy Sciences海德生物總代，Cat.157-8))新鮮制備甲醛溶液。甲醛溶液的毒性很大，即使是稀釋液也要格外小心操作。甲醛溶液對(duì)皮膚有硬化作用，長(zhǎng)時(shí)間接觸可能導(dǎo)致皮膚破裂、皮炎或是過(guò)敏癥狀；甲醛極易揮發(fā)，它對(duì)呼吸道也有影響，長(zhǎng)時(shí)間暴露在甲醛氣體中會(huì)使嗅覺(jué)敏感度降低；此外甲醛對(duì)眼睛也有影響，而且還被認(rèn)為是致癌物質(zhì)致癌物質(zhì)。因此在操作甲醛粉末或溶液時(shí)都必須很小心，帶上手套并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。少量廢棄的醛類試劑（甲醛、戊二醛和丙烯醛等）可以直接在大量流水沖稀的情況下倒進(jìn)水池內(nèi)（但要注意有關(guān)部門(mén)的有關(guān)規(guī)定），當(dāng)然少量的醛類試劑與過(guò)量的1M 甘氨酸混合后，再在大量流水沖稀的情況下倒進(jìn)水池，會(huì)更安全。通常100ml 的甲醛(1%) 需要50ml 的1M 甘氨酸，100ml1%戊二醛則需要35ml，而丙烯醛需要40ml 。大量的醛類試劑必須集中回收處理。
????? 甲醛作為固定劑有如下特點(diǎn)：
???? ?由于甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛強(qiáng)，反應(yīng)溫和，可用于細(xì)胞組織化學(xué)研究的前固定。而且它不象戊二醛有兩個(gè)醛基，引入較少的游離醛基到組織細(xì)胞中，因而在一些細(xì)胞組織化學(xué)研究中更有利。但它的反應(yīng)是部分可逆的，對(duì)細(xì)胞是部分可逆的，對(duì)細(xì)胞基質(zhì)保存差，脫水后大部分基質(zhì)丟失，所以不少實(shí)驗(yàn)室不單獨(dú)使用甲醛來(lái)固定樣品，而將它與戊二醛配制成混合固定液使用。
????? 甲醛對(duì)生物樣品的作用與戊二醛相似，主要引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。在水溶液中，單個(gè)的甲醛分子以HO ? CH2 ? OH 的形式存在。
????? 與戊二醛不同，甲醛既與DNADNA 又與核蛋白反應(yīng)，但這些反應(yīng)都是部分可逆的。另外，甲醛固定脂類的能力不強(qiáng)，可以與脂類相連的蛋白質(zhì)作用。
三、戊二醛（glutaraldehyde ）
????? 戊二醛是一種五碳醛，含有兩個(gè)醛基。分子量為為100。電鏡固定通常用市售的????? 8%戊二醛，Electron Microscopy Sciences，Cat.16020）水溶液稀釋成需要的濃度。其pH 為4.0-5.0 。氧氣、高溫、中性或堿性pH 均能使戊二醛發(fā)生聚合失去醛基，并降低交聯(lián)效力，所以平時(shí)這種原液應(yīng)保存在低溫處。此外戊二醛存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，pH 值會(huì)降低，顏色變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH 值降至3.5以下或含有其它雜質(zhì)時(shí)，必須純化后才能使用。戊二醛對(duì)皮膚有硬化作用，但它的揮發(fā)性較甲醛弱，最好能在通風(fēng)櫥中操作。
????? 戊二醛作為固定劑有如下特點(diǎn)：
????? 它的反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑。但它的滲透速度較慢，必要時(shí)配合甲醛使用效果更佳。它是蛋白質(zhì)的強(qiáng)固定劑。它能快速而不可逆地與氨基反應(yīng)，脫水后生成不穩(wěn)定的Schiff 鍵化合物。
????? 由于戊二醛有兩個(gè)醛基，它可以通過(guò)與相鄰的另一氨基反應(yīng)，而產(chǎn)生交聯(lián)作用。醛基也可能與同一氨基作用，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步與另一戊二醛反應(yīng)，生成丁間醇醛冷凝物 (Aldol condensate)(Aldol condensate)。這種化合物與氧分子共同作用，生成穩(wěn)定的嘧啶類衍生物 (Pyridine derivatives)，并在此過(guò)程中發(fā)生交聯(lián)。戊二醛的這一步與甲醛不同，戊二醛的這一步反應(yīng)是不可逆的，而且需要氧氣的參與。由于大塊的樣品內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足，戊二醛在大塊樣品的內(nèi)部無(wú)法形成穩(wěn)定的生成物，會(huì)導(dǎo)致樣品內(nèi)部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時(shí)，小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過(guò)交聯(lián)作用固定蛋白質(zhì)的過(guò)程會(huì)伴隨氫離子的釋放，使樣品pH值降低。為了維持pH 值穩(wěn)定在最佳水平，在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩沖液。
???? 戊二醛能通過(guò)固定核蛋白來(lái)固定組織和細(xì)胞中的DNA 和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白質(zhì)有關(guān)聯(lián)的或含有氨基和亞氨基亞氨基的脂類。但是只使用戊二醛固定的樣品無(wú)法阻止后面的脫水、滲透和包埋過(guò)程對(duì)樣品脂類的抽提，因而對(duì)細(xì)胞膜的固定效果不理想。?
???? 戊二醛在固定過(guò)程中并不完全破壞細(xì)胞膜的半透膜特性，因而需要選擇合適的固定液滲透壓，以免造成固定假象。但合適的固定液滲透壓隨被固定細(xì)胞和緩沖液的種類改變，很難找到一個(gè)通用的滲透壓。在實(shí)際操作中，1.0%--2.5\%戊二醛（使用0.1M 磷酸鹽緩沖液或液或0.1M 二甲胂酸鹽緩沖液）在一般情況下，已經(jīng)能提供理想的固定效果。除非觀察到明顯的滲透壓造成的假象，一般不對(duì)固定液專門(mén)進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)。
???? 用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間固定（但最好不要超過(guò)一個(gè)星期），因而適用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室或野外現(xiàn)場(chǎng)取材。但戊二醛在稀釋溶液中會(huì)自行發(fā)生一系列反應(yīng)，因而固定液盡可能新鮮配制。?
四、其它固定劑?
???? 醋酸鈾（uranyl acetate）既是一種固定劑又是一種染色劑。它可以與磷酸磷酸基團(tuán)反應(yīng)，從而固定DNA 和RNA，以及含有磷酸基團(tuán)的的磷脂，從而對(duì)膜結(jié)構(gòu)的保存有幫助。另外，它可以與蛋白中的酸性基團(tuán)（如天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基）和和堿性基團(tuán)（如賴氨酸殘基）反應(yīng)從而起固定蛋白的作用。但醋酸鈾不能很好保存糖原。通常在使用了醛類固定劑和四氧化鋨固定劑后，再使用0.5-1.0%的醋酸鈾水溶液進(jìn)行第三重固定。操作醋酸鈾時(shí)要特別注意，盡管市售的醋酸鈾放射性不強(qiáng)，但它仍是一種潛在的致癌物，醋酸鈾應(yīng)密封于棕色瓶陰涼處保存。
???? 丙烯醛（acrolein ）是一種三碳醛，含有一個(gè)醛基和一個(gè)雙鍵。它比甲醛和戊二醛活潑，滲透組織的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和和磷脂，最好作為甲醛或戊二醛固定液的添加劑使用。通常使用市售密封的100%丙烯醛液體，固定時(shí)使用的濃度小于1%。它溶于水的速度慢，毒性很大，著火點(diǎn)低，儲(chǔ)存和使用它都比上述另外兩種醛類危險(xiǎn)，非必要時(shí)不推薦使用。丙烯醛非?；顫娗覔]發(fā)性很強(qiáng)，即使是操作稀釋后的溶液也要格外小心，所有與丙烯醛相關(guān)的操作絕不能離開(kāi)通風(fēng)櫥進(jìn)行，并且最好有經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者在場(chǎng)指導(dǎo)。丙烯醛適合于固定大塊的樣品，植物組織或有厚細(xì)胞壁的微生物樣品樣品，以及表面覆蓋有幾丁質(zhì)或蠟質(zhì)的樣品。但丙烯醛不適用于整個(gè)動(dòng)物的灌注固定。?
???? 丹寧酸（Tannic acid ）是一種從植物中提取的物質(zhì)，泛指五倍子酸（gallic acidgallic acid ）糖苷或多聚糖苷。大分子很難滲透到組織中，因此電鏡中使用低分子量的丹寧酸。丹寧酸既是一種強(qiáng)的固定劑，能固定許多蛋白以及糖類衍生物，又是一種媒染劑，能增強(qiáng)對(duì)重金屬 （如鈾、鉛）的吸收，從而增強(qiáng)樣品反差，特別是細(xì)胞外膜、、彈性纖維、細(xì)胞連接、肌肉纖維等。由于丹寧酸滲透速度慢，通常只用作滲透速度快的固定劑的添加劑使用。丹寧酸沒(méi)有固定的用法，0.5-2.0%丹寧酸和0.5mg/ml
皂角苷（saponin，增加丹寧酸的滲透速度）與2.5-4.0%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定時(shí)間要延長(zhǎng)到3-4 小時(shí)以上，并且推薦使用醋酸鈾作第三重固定。丹寧酸適用于灌注固定。
???? 重鉻酸鉀（potassium dichromatepotassium dichromate）在固定中有兩種作用，一是緩沖作用，二是固定作用，幫助保存脂類和糖類。在處理神經(jīng)組織樣品時(shí)，因?yàn)橹劂t酸鉀能很好地保存髓磷脂，可與四氧化鋨配合使用，作為第二重固定劑。但需要注意的是，重鉻酸鉀是一種致癌物質(zhì)，應(yīng)小心操作。
???? 高錳酸鉀（potassium permanganatepotassium permanganate）可以與脂類反應(yīng)，增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)的反差反差。可以保存DNA和糖原，但有一定的抽提作用，幾乎無(wú)法固定細(xì)胞內(nèi)的顆粒性或纖維狀結(jié)構(gòu)，可能會(huì)引入一些假象。穿透性強(qiáng)，適用于有厚細(xì)胞壁或蠟質(zhì)層包被的植物，使用時(shí)可以不加緩沖液，固定時(shí)間不宜太長(zhǎng)，,0.5-1.0%高錳酸鉀溶液固定30 分鐘到2 小時(shí)。
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