一、免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）??????????????????????????????????????
1、原理和特點
?? 原理：利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標記技術(shù)，通過化學反應(yīng)使標記抗體顯色，對組織細胞內(nèi)的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測的一門技術(shù)。
?? 特點：免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準確，形態(tài)與功能相結(jié)合等特點。
2、示意圖：???????????????
?辣根過氧化物酶（HRP）
3、常見問題分析：
A.顯色過深
?? 一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長，建議降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間。
?? 孵育溫度過高，建議室溫或4℃孵育。
?? HRP標記二抗孵育時間過長，建議縮短時間。
B. 非特異性顯色
?? 石蠟切片脫蠟不徹底，建議延長脫蠟時間。
?? 操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時間。
?? 組織富含內(nèi)源性的生物素與過氧化物酶，建議使用相關(guān)試劑進行封閉。
?? 發(fā)生抗原異位。
?? 蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。
C. 顯色強度弱
?? 一抗?jié)舛冗^低或孵育時間過短，建議增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時間。
?? 試劑超過保質(zhì)期，建議實驗前確認試劑的保質(zhì)期。
操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。
D. 無染色
?? 組織中無目的抗原的表達。
?? 一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認一抗的種屬來源。
?? 顯色物質(zhì)與HRP系統(tǒng)不匹配，建議實驗前確認顯色體系。
二、免疫熒光（Immunofluorescence,IF）
1、原理和特點：
?? 原理：免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標記技術(shù)，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細胞內(nèi)的抗原進行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）技術(shù)。
?? 特點：免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。
2、原理示意圖：
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
A、背景過高
?? 一抗質(zhì)量不高，建議使用特異性高、效價高的一抗。
?? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛取?
?? 封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。
?? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。
?? 可通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。
B、信號弱或無信號
?? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞或組織。
?? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
?? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。
?? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、熒光猝滅快
?? 熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。
?? 用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。
D、細胞有自發(fā)熒光
?? 使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。
?? 材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設(shè)立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數(shù)來消除背景染色。?
?? 細胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量高；培養(yǎng)細胞中死細胞／活細胞比例高；
三、流式細胞術(shù)（Flow Cytometry,? FC）
1、定義、原理
?? 流式細胞儀（FLOW CYTOMETOR）：
??? 進行流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，抗體技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。
?? 流式細胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）：?
利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術(shù)。
2、反應(yīng)原理示意圖：熒光物質(zhì)（FITC、PE等）
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
A、熒光強度/背景過高
?? 一抗/二抗?jié)舛忍撸ㄗh降低一抗/二抗?jié)舛取?/span>
?? 封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。
?? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。
B、信號弱或無信號
?? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞。
?? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
?? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。
?? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、柱形圖分析時出現(xiàn)熒光雙峰
?? 抗原本身特性所決定（比如不同時期的細胞蛋白表達量不同）
?? 進樣針堵塞，建議清洗管路。
?? 進樣速度太快，建議調(diào)低進樣速度。
D、管路系統(tǒng)偏移導(dǎo)致焦距偏離，建議請專業(yè)維修人員校準。
四、免疫組化（IHC）、免疫熒光(IF)、流式細胞術(shù)區(qū)別(FC)：
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流式細胞術(shù)（FC） |
免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF） |
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控制 |
電腦（客觀） |
人（主觀） |
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結(jié)果顯示方式 |
熒光激發(fā)后被探測子捕獲信號 |
化學顯色/熒光通過顯微鏡觀察拍片 |
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樣本 |
單細胞（或顆粒）懸液（流動） |
組織切片/細胞爬片（靜止） |
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細胞數(shù)量 |
大（上萬個） |
小 |
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樣本利用 |
分選后可回收利用 |
不可回收利用 |
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結(jié)果揭示信息 |
細胞群體特征分布 |
揭示細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息 |
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功能 |
可同時檢測多個參數(shù) |
一個或幾個參數(shù) |
| 電話 010-52571502 010-51248120 郵箱 hedebio@163.com |
